SVN-438
Cargando

Procedimiento para la estimación de la concentración de fosfatos en células vivas, colorante xanténico y síntesis del mismo

Se trata de un procedimiento para cuantificar el fosfato soluble en el citoplasma de células vivas mediante la medida de tiempos de decaimiento de fluorescencia y microscopía de imagen de tiempos de vida de fluorescencia (FLIM).

La reacción de transferencia protónica en el estado excitado que ocurre entre la especie neutra y la aniónica del compuesto 9-[1-(2-Metil-4-metoxifenil)]-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona (2-Me-4-OMe TG), solo tiene lugar en presencia de una concentración relativamente baja de un buffer de fosfatos, a pH alrededor de la neutralidad. Esto origina que el decaimiento total de la fluorescencia del sistema, se caracterice mediante dos tiempos de decaimiento individuales. Uno de ellos muy corto es del orden del picosegundo y prácticamente se hace nulo a concentraciones de fosfato mayores de 0,05 M. El otro tiempo de decaimiento es mucho más largo, entre 2’5 y 3’7 ns, y resulta dependiente de la concentración de fosfatos que hay en el medio en donde se encuentra el fluoróforo. Las ventajosas características espectroscópicas del 2-Me-4-OMe TG motivó que se extendiera el estudio fotofísico de este colorante a nivel de moléculas individuales. Como resultado cuantitativo de interés se obtuvo que un incremento de concentración de fosfatos desde 0 hasta 0.3 M decrece el tiempo de decaimiento desde 3.7 ns hasta 3.0 ns, a pH 7.

Con estas bases, se ha desarrollado un procedimiento para estimar la concentración de fosfatos presente en el citoplasma de células vivas, a través de la recuperación de los tiempos de decaimiento de fluorescencia del 2-Me-4-OMe TG (mediante previa excitación láser pulsada) y la conversión en imágenes microscópicas de esos tiempos de decaimiento. Como consecuencia, se ha podido seguir en tiempo real la penetración de iones fosfato en el citoplasma de preosteoblastos en fase de diferenciación celular.

Previamente se añade a la muestra de células una disolución acuosa del colorante xanténico, preferentemente con una concentración de 10-7 mol×L-1. Dado que el colorante empleado tiene carácter apolar, puede atravesar la membrana celular de manera espontánea, permaneciendo en el interior de las células un tiempo superior al necesario para recoger los decaimientos de fluorescencia.

También se ha sintetizado un nuevo fluoróforo xanténico derivado de la fluoresceína, 9-(4-ter-butil-2-metoxifenil)-6-hidroxi-3H-xanten-3-ona, que hemos denominado (2-OMe-4-tBu GG), que posee propiedades espectrales mejoradas respecto al anteriormente utilizado, por lo que también resulta muy adecuado para llevar el cabo el procedimiento descrito.

Innovaciones

Mediante técnicas ya establecidas, se puede calcular la concentración de fosfato y pirofosfato en disoluciones acuosas. En el interior de células solo existe alguna metodología que emplea fósforo radiactivo, con los graves inconvenientes inherentes a esta técnica. Sin embargo, hasta ahora el cálculo de la concentración de fosfato en el interior de células vivas mediante métodos no invasivos y a tiempo real, no se había conseguido nunca.

Ventajas

La principal ventaja de la presente invención es la posibilidad de estimar la concentración de iones fosfato (mono- y di- básico) presente en células vivas y a tiempo real, ya que hasta donde alcanza nuestro conocimiento esto no se había conseguido nunca.

Para ello, se deben de obtener los tiempos de decaimiento de fluorescencia de un colorante xanténico añadido a las células. Estos tiempos de decaimiento se relacionan directamente con la concentración de iones fosfato que hay en el medio.

Se necesita un microscopio de fluorescencia con excitación luminosa mediante un láser de pulsos.

Desde

Demanda de Oferta

  • Introduzca su nombre y apellidos.

  • Introduzca su correo electrónico

  • Introduzca un teléfono de contacto.

  • Escriba las observaciones que estime oportunas para la demanda de oferta.

  • aviso legal

Mapa

X
-3.5991019995 37.1937019956 -3.5951019995 37.1977019956 1
4974 /cms/places/merengue_content_info/68/4974/?lang=es 37.1957019956 -3.5971019995 Procedimiento para la estimación de la concentración de fosfatos en células vivas, colorante xanténico y síntesis del mismo /media/merengue/img/map/default_map_icon.png 1